AAT Bioquest的iFluor 染料过程优化赌钱赚钱app，可用于秀丽卵白质，迥殊是抗体。这些染料亮堂、耐光，对卵白质的淬灭作用最小。它们不错被荧光仪器的主要激光芒（举例350、405、488、555和633nm）很好地激勉。iFluor®647系列的光谱特点与Cy5 基本交流。与Cy5®探针比拟，iFluor 647试剂具有更强的荧光和更高的光相识性。它们的荧光在pH 3至11规模内与pH无关。这些光谱特点使这种新的染料家眷成为Cy5和Alexa Fluor 647的绝佳替代品（Cy5与Alexa Fluor是GE Health Care和Invitrogen的商标）。iFluor®647 SE卓绝相识，与卵白质氨基具有风雅的反映性和遴荐性。

艾好意思捷iFluor 647琥珀酰亚胺酯：

货号：AAT-71560

单元大小：1 毫克

分子量：1274.66

溶剂：DMSO（二甲基亚砜）

改换因子（260 纳米）：0.03

改换因子（280 纳米）：0.03

改换因子（656 纳米）：0.0793

消光统共（cm -1 M -1）：250000

激勉（纳米）：656

辐射（纳米）：670

量子产率：0.25

H-短语：H303, H313, H333

危机秀丽：XN

预期用途：仅限磋商使用（RUO）

R-短语：R20, R21, R22

储存：冷冻（< -15 °C）；尽量减少光照贯通

库存溶液的准备：除非另有阐述，统共未使用的库存溶液应在制备后分红单次使用的小份，并储存在 -20 °C。幸免反复冻融轮回。

卵白质库存溶液（溶液 A）：

将 100 微升的反映缓冲液（举例，1 M 碳酸钠溶液或 pH 约 9.0 的 1 M 磷酸缓冲液）与 900 微升的倡导卵白质溶液（举例，抗体，卵白质浓度尽可能大于 2 mg/mL）夹杂，得到 1 毫升卵白质秀丽库存溶液。

驻扎：卵白质溶液（溶液 A）的 pH 值应为 8.5 ± 0.5。淌若卵白质溶液的 pH 值低于 8.0，请使用 1 M 碳酸氢钠溶液或 1 M pH 9.0 磷酸缓冲液调养 pH 值至 8.0-9.0 规模内。

驻扎：卵白质应融化在 1X 磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）中，pH 7.2-7.4。淌若卵白质融化在 Tris 或甘氨酸缓冲液中，必须对其进行透析，以抗争 1X PBS，pH 7.2-7.4，以去除庸俗用于卵白质千里淀的游离胺或铵盐（如硫酸铵和醋酸铵）。

驻扎：不纯的抗体或用牛血皎白卵白（BSA）或明胶相识的抗体将不会被很好地秀丽。亚硝酸钠或硫柳汞的存在也可聪颖扰偶联反映。亚硝酸钠或硫柳汞不错通过透析或旋转柱走动除，以赢得最好的秀丽结束。

驻扎：淌若卵白质浓度低于 2 mg/mL，偶联恶果将显赫裁减。为了赢得最好的秀丽恶果，提出最终卵白质浓度规模在 2-10 mg/mL 之间。

iFluor™ 647 SE 库存溶液（溶液 B）：

向 iFluor™ 647 SE 的瓶中加入无水 DMSO，制成 10 mM 库存溶液。通过移液或涡旋夹杂均匀。

驻扎：在开动偶联之前准备染料库存溶液（溶液 B）。请立即使用。染料库存溶液的始终储存可能会裁减染料活性。溶液 B 不错在避光和防潮的情况下在冷冻库中储存两周。幸免冻融轮回。

样品执行条约：

这个秀丽条约是为山羊抗小鼠 IgG 与 iFluor™ 647 SE 的偶联而建树的。您可能需要把柄您的特定卵白质进行进一步优化。

驻扎：每种卵白质齐需要不同的染料/卵白质比例，这也取决于染料的性质。过度秀丽卵白质可能会对其齐集亲和力产生不利影响，而染料/卵白质比例过低的卵白质偶联物则贤达度裁减。

进行偶联反映：

使用 10:1 的溶液 B（染料）/溶液 A（卵白质）的摩尔比例手脚起头：将 5 微升的染料库存溶液（溶液 B，假定染料库存溶液为 10 mM）加入卵白质溶液（95 微升的溶液 A）的瓶中，并有用摇动。假定卵白质浓度为 10 mg/mL，卵白质分子量约为 200KD，卵白质的浓度约为 0.05 mM。

驻扎：咱们提出使用 10:1 的溶液 B（染料）/溶液 A（卵白质）的摩尔比例。淌若太低或太高，请辞别笃定 5:1、15:1 和 20:1 的最好染料/卵白质比例。

无间在室温下旋转或摇动反映夹杂物 30-60 分钟。

纯化偶联物：

以下是一个使用 Sephadex G-25 柱纯化染料-卵白质偶联物的示例条约。

把柄制造商的阐述准备 Sephadex G-25 柱。

将反映夹杂物（来自“运行偶联反映”）加载到 Sephadex G-25 柱的顶部。

当样品刚刚低于顶部树脂名义时，立即添加 PBS（pH 7.2-7.4）。

添加更多的 PBS（pH 7.2-7.4）以完成所需的样品柱纯化。归并包含所需染料-卵白质偶联物的分数。

驻扎：淌若立即使用，染料-卵白质偶联物需要用染色缓冲液稀释，并分装屡次使用。

驻扎：关于始终储存，染料-卵白质偶联物溶液需要浓缩或冷冻干燥。

表征所需的染料-卵白质偶联物

取代度（DOS）是表征染料秀丽卵白质的最进军成分。较低 DOS 的卵白质频繁具有较弱的荧光强度，但较高 DOS 的卵白质也倾向于裁减荧光。关于大多半抗体，保举的最优 DOS 在 2 到 10 之间，具体取决于染料和卵白质的性质。为了有用秀丽，应适度取代度，使每摩尔抗体有 4-6 摩尔的 iFluor™ 647 SE。以下要津用于笃定 iFluor™ 647 SE 秀丽卵白质的 DOS。

测量罗致：

为了测量染料-卵白质偶联物的罗致光谱，提出保捏样品浓度在 1-10 µM 规模内，具体取决于染料的消光统共。

读取 OD（吸光度）在 280 纳米和染料最大罗致（λmax = 656 纳米，关于 iFluor™ 647 染料）

关于大多半分光光度计，需要将样品（来自柱分数）用去离子水稀释，以便 OD 值在 0.1 到 0.9 的规模内。280 纳米的 O.D.（吸光度）是卵白质的最大罗致，而 656 纳米是 iFluor™ 647 SE 的最大罗致。为了赢得准确的 DOS，请确保偶联物中不含未偶联的染料。

图：HeLa细胞用小鼠抗微管卵白染色赌钱赚钱app，然后用iFluorTM 647山羊抗小鼠IgG（H+L）（红色）染色；细胞核用DAPI（蓝色）染色。